产品货号:
YTB4143
中文名称:
Cas9核酸酶(H840A突变,含核定位信号)
英文名称:
Cas9 Nickase(H840A,NLS)
产品规格:
100pmol|500pmol
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1~3天
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Cas9核酸酶(H840A突变,含核定位信号)是表达纯化获得的一种含核定位信号(NLS),能在gRNA引导下序列特异性地切割单链DNA的核酸内切酶的,H840A突变体。
Cas9 Nickase(H840A,NLS)是通过对Cas9核酸酶的HNH结构域内的单个氨基酸突变产生的H840A突变体。与野生型的Cas9核酸酶一样,Cas9 Nickase(H840A,NLS)利用gRNA靶向目标DNA序列,但是与切割双链的野生型不同,由于HNH结构域的突变,Cas9 Nickase(H840A,NLS)NLS仅仅切割与gRNA非互补的DNA链(图1)
图1.Cas9 Nickase(H840A,NLS)基因编辑示意图。
- 本制品脱靶率低,特异性强。在基因编辑时需要两条gRNA靶向定位(相距范围一般在0~20bp),双链切割后产生5'末端,易于进行同源重组,极大地降低了脱靶效应,使得基因编辑的特异性增强,避免后续实验中由于非特异性编辑产生的负面影响。
- 有核定位序列,编辑效率高。Cas9 Nickase(H840A,NLS)在蛋白的N端和C端都含有SV40 T抗原的核定位序列(NLS),使Cas9 Nickase与gRNA形成的复合物在转染进入细胞后、能迅速地从细胞质进入到细胞核内,从而大大地提高了基因编辑的效率。Cas9 Nickase可以通过显微注射、电穿孔和脂质体介导等方法进入细胞,而这种不需要使用DNA的系统不会产生外源DNA整合至细胞基因组的风险。
通过E.coli重组、表达、纯化而获得,表达基因来源于Streptococcus pyogenes。
体外筛选高效、特异性gRNA;与两种特定gRNA结合后利用电穿孔或者显微注射进行体内的基因编辑。
组分 | 100pmol | 500pmol |
Cas9 Nickase(H840A,NLS,1μM) | 100μL | |
Cas9 Nickase (H840A,NLS,20μM) | 25μL | |
10×Cas9 Nickase Reaction Buffer | 0.5mL | 2mL |
保存:-20℃,避免反复冻融,有效期1年。
10mM Tris,300mM NaCl,0.1mM EDTA,1mM DTT,50% (v/v) Glycerol,pH7.4@25℃。
10×Cas9 Nickase Reaction Buffer:
500mM Tris-HCl,1M NaCl,100mM MgCl2,1mg/mL BSA,pH7.9@25℃。
1μM (160ng/μl);20μM (3.2μg/μl)。
SDS-PAGE电泳后纯度≥95%,不含DNA外切酶,不含非gRNA依赖的DNA内切酶,不含RNA酶,不含磷脂酶。
- 本制品使用时会涉及gRNA和DNA的操作,必须注意RNase-free和DNase-free的相关操作。所有自行准备的试剂和耗材也都应是Nuclease-free的。如果可能有核酸酶污染,可考虑用0.01%的DEPC处理过夜,然后高温高压处理后使用。操作时建议戴一次性口罩操作。
- 对于操作环境中核酸酶的去除,推荐使用核酸酶喷雾清除剂以去除实验桌、仪器设备等表面或其它接触面上的核酸酶。反应体系中推荐加入RNase Inhibitor以保护RNA不被降解。
- 本制品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品。
- 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
百奥莱博供应的Cas9 Nickase(H840A,NLS)体外酶活检测效果请参考图2。
图2.Cas9 Nickase(H840A,NLS)体外酶活检测的效果图。反应体系:20μL水、3μL 10×Cas9 Nickase Reaction Buffer、3μL 300nM gRNA (Target sequence:5'-GGTTAATGTCATGATAATAA-3')、1μL Cas9 Nickase(H840A,NLS) (分别为1/16、1/4、1pmol),25℃预孵育10分钟。然后加入3μL 30nM的pUCm-T质粒,37℃孵育15分钟;然后加入1μL 蛋白酶K溶液(20mg/mL),室温孵育10分钟以终止反应;最后加入6μL 6×DNA上样缓冲液,进行电泳检测。gRNA与Cas9 Nickase结合后,引导后者至pUCm-T与gRNA互补的序列互补的序列酶切产生缺刻,致使质粒形成开环,而野生型的Cas9会使质粒发生线性化。如图2所示,本制品与N公司的竞品具有相当的酶活性。实际检测效果会因样品种类、检测条件等的不同而存在差异,本图仅供参考。
- Cas9 Nickase (H840A) NLS体外消化DNA。
- 融解并混匀体外消化反应所需的各种溶液。将Cas9 Nickase(H840A,NLS)、gRNA、底物DNA置于冰浴上,使用无核酸酶水稀释gRNA至300nM,底物DNA至30nM。用无核酸酶水稀释适量10×Cas9 Nickase Reaction Buffer至1×。推荐取适量20μM浓度的Cas9 Nickase使用1×Cas9 Nickase Reaction Buffer稀释至μM备用,稀释后宜尽快使用,不宜冻存后使用,以避免反复冻融导致酶活性下降。推荐使用Ultrapure Water(DNase/RNase-Free,Sterile)
- 按照下表配制反应体系。
成分 用量 超纯水(DNase/RNase-Free) 20μL 10×Cas9 Nickase Reaction Buffer 3μL gRNA (300nM) 3μL Cas9 Nickase(H840A,NLS,1μM) 1μL 总体积 27μL - 用移液器轻轻吹打混匀或用涡旋混合器在最低速度轻轻混匀,室温离心数秒,使液体积聚于管底。25℃预孵育10分钟。
- 加入3μL 30nM底物DNA (反应体系终体积为30μL),用移液器轻轻吹打混匀或用涡旋混合器在最低速度轻轻混匀,随后离心沉淀液体,37℃孵育15分钟,反应时间可以根据实际情况适当延长至30~120分钟。
- 每个样品中加入1μL 蛋白酶K,轻轻混匀,室温孵育10分钟。
- 每个反应体系中加入6μL 6×DNA上样缓冲液,然后使用适当浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分析。如果不立即电泳,可以-20℃保存备用。通过体外的Cas9酶切实验,可以判断所设计的gRNA的效果是否理想或者优化筛选出理想的gRNA用于细胞或动物实验。
- 融解并混匀体外消化反应所需的各种溶液。将Cas9 Nickase(H840A,NLS)、gRNA、底物DNA置于冰浴上,使用无核酸酶水稀释gRNA至300nM,底物DNA至30nM。用无核酸酶水稀释适量10×Cas9 Nickase Reaction Buffer至1×。推荐取适量20μM浓度的Cas9 Nickase使用1×Cas9 Nickase Reaction Buffer稀释至μM备用,稀释后宜尽快使用,不宜冻存后使用,以避免反复冻融导致酶活性下降。推荐使用Ultrapure Water(DNase/RNase-Free,Sterile)
- 也可以通过适当的蛋白转染试剂把Cas9 Nickase-gRNA转染至细胞内,具体请参考相应的蛋白转染试剂的产品说明书。
- 为什么观察到目的DNA切割不完全?
- 可能是由于Cas9 Nuclease、gRNA、target DNA的比例不合适引起的,推荐Cas9 Nickase、gRNA、target DNA的摩尔比例至少为10:10:1。也可以通过适当延长反应时间使反应更加充分。
- 可能与gRNA的序列有关,可以根据target DNA选择更合适的gRNA序列,不同的gRNA的效果会差别比较大。
- 可能由于gRNA降解引起的,可以通过凝胶电泳验证gRNA的完整性。
- 反应缓冲液可能不合适,请使用Cas9 Nickase自带的缓冲液10×Cas9 Nickase Reaction Buffer。
- 可能是由于Cas9 Nuclease、gRNA、target DNA的比例不合适引起的,推荐Cas9 Nickase、gRNA、target DNA的摩尔比例至少为10:10:1。也可以通过适当延长反应时间使反应更加充分。
- 为什么不同的gRNA之间的消化效率存在差异?
- gRNA的序列设计可能会影响消化效率,所设计的gRNA需要进行序列与模板的验证。
- gRNA的质量也可能会影响消化效率,利用琼脂糖凝胶电泳验证gRNA的完整性。
- gRNA的序列设计可能会影响消化效率,所设计的gRNA需要进行序列与模板的验证。
- 如何优化用于基因编辑的gRNA对?
- 相比于3'突出的末端,产生5'突出的末端可以提高基因编辑的效率。利用Cas9 Nickase进行基因编辑的报道表明,当gRNA对以尾对尾(即5' - 5')的方向定向,在切割后可以产生5'突出的末端。
- 控制gRNA对间隔的距离。当gRNA对的间隔在10~30bp时可以进行有效的基因编辑。重叠的gRNA对和相隔较远的gRNA对(≥40bp)也可以检测到编辑,但效率较低。建议尝试多种gRNA对,以获得最佳的编辑效率。
- 相比于3'突出的末端,产生5'突出的末端可以提高基因编辑的效率。利用Cas9 Nickase进行基因编辑的报道表明,当gRNA对以尾对尾(即5' - 5')的方向定向,在切割后可以产生5'突出的末端。
- 如何将酶稀释至1μM用于体外消化反应?
- 如需使用较高浓度的酶体外酶切DNA,可将酶在1×Cas9 Nickase Reaction Buffer中稀释至1μM后立即使用。稀释后不能冷冻保存。
- 如果1μM稀释液需要在-20℃保存,则应在反应组装前使用酶稀释溶液:10mM Tris-HCl,300mM NaCl,0.1mM EDTA,1mM DTT,500μg/mL BSA,50% (v/v) Glycerol (pH7.4@25℃)进行稀释。
- 如需使用较高浓度的酶体外酶切DNA,可将酶在1×Cas9 Nickase Reaction Buffer中稀释至1μM后立即使用。稀释后不能冷冻保存。
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